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021-50276769蛋白與配體能否結(jié)合、結(jié)合的強弱會直接影響蛋白檢測或純化實驗的成敗。此篇文章由月旭科技首xi科學(xué)家王國斌博士執(zhí)筆，對蛋白結(jié)合和解離常數(shù)進行了較為系統(tǒng)的講述。
蛋白和配體結(jié)合的強弱不同，對于蛋白檢測以及親和分離純化實驗有顯著影響。在設(shè)計實驗時應(yīng)考慮這種結(jié)合強弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括zui低檢測限濃度），估算結(jié)合時間，獲得最佳并且實用的結(jié)果。 這對于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為重要。
常規(guī)的蛋白檢測方法，比如ELISA，只能測定實驗結(jié)束時的蛋白結(jié)合數(shù)值，不能跟蹤整個過程。這不利于獲取結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)，阻礙了實驗的優(yōu)化。自從上個世紀90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術(shù)后，目前已有幾種生物傳感器技術(shù)，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結(jié)合過程，檢測結(jié)合的全部過程，給出結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)。下圖是我在SRU Biosystems用光學(xué)生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時間變化的結(jié)合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結(jié)合在2-3分鐘內(nèi)迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時，結(jié)合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結(jié)合在180分鐘內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地增加。濃度小于1μg/mL時，結(jié)合仍然進行，但是十分緩慢。
絕大多數(shù)生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，確定蛋白的濃度和結(jié)合時間通常根據(jù)結(jié)合的強弱來確定，而結(jié)合強弱是通過解離常數(shù)來判斷的。
在化學(xué)、生物化學(xué)中，解離常數(shù)（KD) 是一種反應(yīng)的平衡常數(shù)，用于測量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。 雖然解離常數(shù)是動力學(xué)理論的參數(shù)， 但是它在生物化學(xué)，尤其實驗設(shè)計上有現(xiàn)實意義的指導(dǎo)作用。
對于一個可逆的蛋白結(jié)合過程
（1）P+L?P L
PL是蛋白P和配體L的親和產(chǎn)物。解離常數(shù)KD定義為
（2）KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA
其中[P]e’[L]e和[PL]e分別是到達平衡時，P、L和結(jié)合物PL的濃度。KA是結(jié)合常數(shù)。結(jié)合率?定義為蛋白P與配體L結(jié)合成PL的比例。
（3）?=[PL]_e/[P]t
[P]t是起始的蛋白P總濃度。平衡時蛋白濃度
（4）[P]e= [P]t-[PL]e
等式（2）變成
(5) KD=（[P]t-[PL]_e）[L]e/[PL]
等式（5）變成
(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
結(jié)合率?轉(zhuǎn)化為
（7） ?=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
平衡時省余未結(jié)合配體濃度
（8）[L]e=? KD/(1-?)
當?shù)鞍譒有一半結(jié)合時，?=0.5
（9） [L]e=KD
最后平衡狀態(tài)結(jié)合配體的濃度就等于解離常數(shù)。下面闡述其實用價值。
例如KD為1nM時，最后剩余的配基平衡濃度為1nM，一半的蛋白會與配體結(jié)合（?=0.5）。KD為5nM時，最后剩余的配體平衡濃度為5nM時，一半的蛋白會與配體結(jié)合（?=0.5）。如果想要提高蛋白結(jié)合率到六成（?=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達到最后配基平衡濃度分別為1.5nM（KD=1nM）和7.5nM（KD=5nM）。對于蛋白A填料來說，配體就是抗體，不同動物/總類的抗體有不同的KD。如果給與足夠時間，結(jié)合達到平衡后（靜態(tài)載量），沒結(jié)合抗體的濃度也不同。KD小，會有更高的靜態(tài)載量，分離得更*。 要想提高低KD抗體的載量，只能提高填料表面蛋白A的密度。如果時間短，沒有達到最后的結(jié)合平衡，現(xiàn)實的例子就是抗體流過蛋白A填料柱。在相同時間里，KD小的，會有更多的抗體與蛋白A結(jié)合。對于同樣的KD流速低，時間長，動態(tài)載量也會更高。
反之， 在最后配體平衡濃度為8nM（圖中紅線）時，KD小（1nM）的蛋白結(jié)合率能達到0.89，而KD大（5nM）的蛋白結(jié)合率只有0.62。 這對于無蛋白檢測時，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測抗體）或者熒光標記的二抗以及鏈霉親和素（Streptavidin）濃度確定后，KD對蛋白（被檢測物）的濃度測定的影響就顯而易見。KD小的被檢測蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結(jié)合率高，檢測結(jié)果更準確。如果KD較大，就要提高二抗?jié)舛龋源_保檢測數(shù)據(jù)可信度，或者縮短實驗周期。
在分子生物學(xué)上，KD<10-8M (10nM或者0.01μM)屬于強結(jié)合； 10-4M>KD>10-8M屬于中等結(jié)合；KD>10-4M (0.1mM)屬于弱結(jié)合。蛋白A與不同種類抗體結(jié)合的強弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的KD約為2×10?9M，屬于強結(jié)合。下表列出不同抗體與蛋白A結(jié)合的強弱情況。蛋白檢測，分離純化過程中，應(yīng)該參照結(jié)合強弱，設(shè)計操作方案。
鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學(xué)常用的試劑。它于生物素（biotin）結(jié)合的KD非常小，僅為~10?14M。 強度與共價鍵類似。前文介紹過，鏈霉親和素是非常穩(wěn)定50KD蛋白，經(jīng)常用來與熒光、紅外、ELISA標記等化學(xué)結(jié)合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學(xué)結(jié)合。這樣帶有標記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結(jié)合，從而避免直接標記蛋白。鏈霉親和素和生物素KD小。對比于直接標記二抗的方法，采用標記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時間短，達到準確檢測的目的。基于這種原因，標記的鏈霉親和素、化學(xué)活化的生物素以及生物素結(jié)合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買，這對于實驗方案設(shè)計非常便利。
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