四氫呋喃(THF)是反相色譜中洗脫能力極強的溶劑，比甲醇和乙腈都強很多。在流動相中加入THF能改善某些難分離的物質對的分離度。但THF不穩定，容易降解生成具有很強反應活性的過氧化物，能與分析物反應生成新化合物，導致拖尾、峰分裂和鬼峰產生。高反應活性的過氧化物還可以和填料固定相發生化學作用，這個過氧化物對柱子會有損傷，而且這種損傷是隨時間累積的。THF保質期一般規定是6個月，放得越久，里面產生的過氧化物含量越大，應該避免使用生產日期已很久的THF溶劑，而且最好將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能檢測一下過氧化物的含量。

在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；

緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機溶劑。當加入有機溶劑時，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。

對于液相常用濃度來說，緩沖液應維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右，當濃度特別稀的時候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個pH單位。

表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）

建議在開發方法的時候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調分離。這個策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。

1）建議溫度設置在25℃-40℃，適當的柱溫保持良好的保留時間的重現性，一定程度上提高柱效，增加分離度。

2）柱溫過低，流動相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。

3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對試劑或緩沖鹽對硅膠基質的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。

4）溫度的改變會導致保留時間漂移，如果儀器自動進樣過夜或過周末，就會發現保留時間隨著實驗室溫度的改變而產生漂移，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。 

1）檢測器對樣品和流動相的吸收差值就是峰的響應值，溶劑峰就是配置樣品的溶劑進入系統后，所產生的吸收與流動相吸收的差值，一般是最前面的峰。

2）只要進樣就會有系統峰出現，和使用什么溶劑沒有什么關系，如果是梯度，一般在梯度回到起始比例平衡系統的時候也會有系統峰，任何物質都不應該在這之后出峰。

3）溶劑峰與檢測時的波長有關系，波長的選擇可以使溶劑峰出現或隱蔽。

4）流動相和稀釋劑選擇的時候一般就要求使用在檢測波長沒有響應或響應很低的試劑，選擇稀釋劑的時候應盡可能的選擇流動相。

如果倒峰并不干擾試驗，所以，只要忽視它就可以了。當然，如果你在控制環境指標，那么就要仔細考慮了。

倒峰是溶劑在該波長下比流動相的吸收更弱，所以有峰就代表可能有物質吸收。峰代表著樣品與流動相的差別，與正峰還是倒峰，是否保留無關。對于我們大部分人來說，并不擔心這一點。我們知道這只是由于溶液與流動相的差異導致的。因此我們要做的是找出是什么導致了圖譜中出現了額外的峰。這個峰是倒的給我們提供了有用的信息，這些峰是有樣品溶液與流動相的差別導致的。有可能是成分不同，也有可能是pH不一樣。只有非常小心的用流動相配制樣品，才能避免出現倒峰。

要確定那個多出來的峰時來源于外來物還是其他地方，只要進一個標準品就好了。如果是外來物質的峰，那么在標準品中就不會有峰。這個峰在進標準品甚至是流動相的時候都有。如果換了樣品還是出現這種現象，那么就應該把樣品排除嫌疑范圍了。所以，要關注到儀器或者流動相本身了。如果多出來的峰是正峰，要考慮進樣器，注射器，樣品瓶蓋或類似的有沒有污染。流動相本身和所有與其接觸的部件都有很大可能是問題的根源。

關于漂移問題：

1）溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定。

2）流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等。

3）柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡。

關于快速變化問題：

1）流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定。

2）泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。

3）流動相不合適，解決辦法為改換合適的流動相或預先混合流動相。

如果你是手動進樣，確定下你是不是忘了扳動六通閥（使用的進樣器是六通閥），然后檢查下色譜柱壓力是否正常（有沒存在沒打起液體的情況，是否有漏液現象），最后復查一下分析方法（如流動相配比、檢測波長、樣品配制濃度等）是否可靠。分析方法是否適合待測樣品，是否存在保留過強導致未洗脫的情況。

這很有可能是流通池內有氣泡。請先停泵來進行確認，如果毛剌消失，則很有可能是由于流動池內有氣泡。需要沖洗流動池。如果毛剌仍然存在，則需檢查檢測器本身的電噪音有關，或者色譜內部有污染；若儀器系統進入氣泡，可以用純的異丙醇或者純甲醇有機相進行沖洗排除，色譜柱污染，故對色譜柱進行強洗脫溶劑進行沖洗。

1)柱溫波動：(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)。控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。

2)流動相不均勻：(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移)。使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑，流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氦氣。

3)流通池被污染或有氣體：用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用硝酸(不要用鹽酸)。

4)檢測器出口阻塞：(高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線)取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

5)流動相配比不當或流速變化：更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

6)柱平衡慢特別是流動相發生變化：用中等強度的溶劑進行沖洗,更改流動相時，在分析前用10~20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。

7)流動相污染、變質或由低品質溶劑配成：檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及 HPLC 級的溶劑。

8)樣品中有強保留的物質(高K值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐升高的基線：使用保護柱，如有必要,在進樣之間或在分析過程中,定期用強溶劑沖洗柱子。

9)使用循環溶劑，但檢測器未調整：重新設定基線。當檢測器動力學范圍發生變化時，使用新的流動相。

10)檢測器沒有設定在最大吸收波長處：將波長調整至最大吸收波長處。

可能的原因：

1）泵頭中有氣泡

2）單向閥順壞

3）柱塞密封圈損壞

4）脫氣不充分

5）系統漏液

6）使用了梯度洗脫