非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業染料，有強致癌性。因其色澤鮮艷、勻染性好、價格低廉等特點，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測范圍。目前，國家已經發布3個推薦性的食品中酸性橙Ⅱ專用檢測標準，但由于不同實驗室間儀器、人員、實驗耗材、樣品等條件存在差異，*執行方法就能達到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據實際情況進行方法的優化是必要的。

近，小編在用不同的基質按照標準《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時，發現回收率不很理想，而且6.1.2所規定的固態樣品前處理方法非常耗時（特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步）。因此小編依據標準方法對不同實驗環節進行了一些優化，在這里將全過程分享給各位朋友以供參考交流~

樣品凈化步驟

樣品凈化步驟優化涉及SPE小柱與濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。

首先，我們需要按標準方法進行實驗，驗證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當下實驗條件需求：

1. 根據標準3.6節（見下圖）選擇對應的SPE小柱。

由此，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱（500mg/6ml,30pk，貨號：00509-11006）。

2. 使用酸性橙Ⅱ標準溶液，按標準6.1.3節的凈化方法（見下圖）進行固相萃取操作（小柱的活化方法見3.6），留取每一操作步驟的樣液用于上機檢測。

在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標準溶液，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進行上機檢測（此方法又稱“分步留樣”，是分析SPE操作過程中影響回收率的環節及原因的常用方法）。

3. 選擇合適的濾膜過濾樣液，上機檢測。

根據6.1.3，樣液上機前要過膜凈化。我們都知道，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質污染色譜柱。但使用濾膜（或使用不合適的濾膜）可能會影響目標物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嘗試了三種過膜方式：1) 不過膜；2) 水系濾膜；3) Nylon濾膜。

藍色為樣液不過膜，峰面積12.0191

粉色為樣液過水系濾膜，峰面積11.4695

黑色為樣液過Nylon濾膜，峰面積6.4975

結果發現過膜后，過膜樣液的圖譜峰面積：過Nylon濾膜＜過水系濾膜＜不過膜，說明過水系膜或有機系膜都對目標物造成一定損失。因此后續實驗的樣液均不過膜上機。建議本實驗樣液上機前不過膜。

后，小編發現上樣液、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒有目標物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ終的回收率已經達到了95%-105%，滿足了檢測的要求。

樣品提取步驟優化

其次，按照標準方法小編進行了空白基質加標實驗，驗證樣品提取步驟是否影響不同基質樣品中目標物的回收。實驗方法如下圖所示。

實驗過程中，小編發現：

6.1.2 固態試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配制方法見3.4）提取2遍，再合并提取液，濃縮至10mL。

此時洗脫液總量約40mL，需40℃濃縮至10mL左右【相當于除去乙醇】。整個濃縮過程非常耗時，差不多處理一個樣要一小時，而且終的結果回收率非常不理想。

按照第yi次實驗的結果，小編進行了一些優化，標準上是全部提取液濃縮至10mL左右后凈化，改為移取了其中20mL經濃縮至約5mL后上樣。

根據第二次實驗結果，回收率已經達到了90%-100%，滿足了檢測的要求。

終優化后的實驗步驟和譜圖

一、提取

稱取樣品2g（±0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min（4000r/min），吸取上清液于另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重復提取一次，合并兩次上清液，混勻，準確移取20mL上清液，40℃旋轉蒸發至少于5mL,轉移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待凈化。

二、凈化

SPE柱：月旭Welchrom® NH2規格：500 mg/6mL

活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過柱，棄去流出液

上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干，棄去流出液

淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液

洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL試管中，抽干小柱

濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測。

三、儀器條件

色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm

流動相：乙酸銨：甲醇=35:65

柱溫：35℃

進樣量：20μL
檢測波長：484nm

流速：1.0mL/min

總結

在優化標準方法的時候：

1）先選擇合適的SPE小柱，用目標物標準溶液進行固相萃取操作，分步排查SPE步驟，確認小柱與標準方法是否滿足具體要求；

2）再按標準方法，做空白基質加標，確認前處理樣品提取步驟中目標物的損失情況，分析造成目標物損失的原因及步驟，有針對性優化方法；

3）接著做樣品和樣加標，看目標物回收率情況，優化提取量或提取次數；后得出一個穩定的方法，保證滿足標準回收率要求進行檢測。